山羊痘病毒實時熒光PCR檢測試劑盒說明書

【用途】 用于山羊痘病毒核酸的檢測。

【試劑】

【山羊痘病毒實時熒光PCR檢測試劑盒說明書操作步驟】

1.樣本前處理及核酸提取  

樣本前處理：

取適量皮膚丘疹、肺部病變組織、淋巴結(jié)，于滅菌研缽充分研磨，用PBS按照1：3體積稀釋成均勻乳劑，經(jīng)10 000rpm離心3 min。

核酸提?。?/span>

(1)取200μL上述樣本離心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL離心管,然后加入200μL裂解液，劇烈振蕩。(蛋白酶K開蓋使用后建議存于2-8℃)混勻5～10秒。

(2)56℃溫浴10分鐘。

(3)在上述離心管中加入200μL無水乙醇，充分振蕩混勻5～10秒。

(4)將步驟3中混勻的液體轉(zhuǎn)移至一只套有收集管的純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，棄去套管內(nèi)液體。

(5)將500μL去蛋白漂洗液加入純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，并棄去套管內(nèi)液體。

(6)將700μL洗滌液加入純化柱上，10 000rpm離心1分鐘，并棄去套管內(nèi)液體。

(7)可選：重復(fù)步驟（6）。

(8)再將純化柱放回接液管上，13 000rpm離心1分鐘。

(9)將純化柱移到一只干凈的1.5mL離心管中。

(10)向離心柱內(nèi)加50μL洗脫液，室溫靜置1分鐘后12 000rpm離心1分鐘，棄純化柱，離心管內(nèi)液體中含有基因組DNA。提純的基因組DNA如果不立即使用，請保存于-20℃。

2. 熒光PCR加樣體系（總體系20 μL）：將下列試劑加入PCR反應(yīng)管中。

（注：陰、陽性對照設(shè)立，由試劑盒提供的陽性對照、滅菌水直接替換“模板"即可。）

3. 反應(yīng)程序

在熒光PCR儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：95 ℃ 180s，循環(huán)95 ℃ 5 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，共45次, 每次循環(huán)的第三步（72℃ 20 s）收集熒光信號（報告基團(tuán)“HEX"，淬滅基團(tuán)“BHQ1"）。

【結(jié)果判定】

1 閾值設(shè)定

檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和 Ct值直接讀取檢測結(jié)果，Ct值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點為準(zhǔn)。

2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

(1) 陰性對照：無Ct值無擴(kuò)增曲線。

(2) 陽性對照：Ct值≤30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。若陰、陽性對照組結(jié)果不成立，則視為無效檢驗。

3 結(jié)果描述及判定

陰性  被檢樣品無Ct值且無明顯擴(kuò)增曲線，判為山羊痘病毒核酸陰性；

陽性  檢測樣品Ct值≤42.0且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線時，判為山羊痘病毒核酸陽性；

可疑  對于Ct值＞42.0的樣品且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線或者Ct值≤42.0但無典型的擴(kuò)增曲線時，應(yīng)重檢，重檢Ct值≤42.0且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線時判為陽性，其他情況均判為陰性。

【注意事項】

1.B盒使用之前請*溶解并離心數(shù)秒后使用，蛋白酶K開蓋使用后建議保存于2-8℃。

2 反復(fù)凍融試劑將降低檢測靈敏度，盡量減少反復(fù)凍融。

3 為避免樣本間的交叉污染，模板最后加，加模板時先加陰性對照，再加檢測樣品，最后加陽性對照，有條件的實驗室加模板的移液器應(yīng)與加其它組份的移液器分開。

4 上機(jī)前注意檢查確保反應(yīng)混合液內(nèi)無氣泡，且反應(yīng)管蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏區(qū)污染儀器。

【生產(chǎn)企業(yè)】  

企業(yè)名稱：山東綠都生物科技有限公司

生產(chǎn)地址：山東省濱州市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)黃河二路169號綠都生物工程高科技園      

【有效期】本制品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝內(nèi)側(cè)。

僅供獸醫(yī)診斷使用

長期提供原核、真核蛋白表達(dá)構(gòu)建服務(wù)

長期 提供抗原偶聯(lián)、 HRP、生物素、糖基化、親和素、FITC等偶聯(lián)標(biāo)記多肽、抗體、抗原、蛋白等服務(wù)